Estudo de genes de Candida albicans com função desconhecida quanto à formação de biofilme, características biológicas e interação patógeno- hospedeiro / Study of unknown function genes of Candida albicans as to biofilm formation, biological characteristics, and host-pathogen interaction

Candida albicans é um fungo oportunista capaz de causar infecções superficiais e até sistêmicas. A maioria das infecções é mediada pela formação de biofilme que confere resistência aos agentes antifúngicos e ao sistema imune, porém os mecanismos de desenvolvimento do biofilme e patogenicidade ainda não foram completamente elucidados. No presente estudo foram selecionados 9 genes de C. albicans com função desconhecida, dentre 34 cepas mutantes que apresentaram fenótipo alterado para formação de biofilme. Os biofilmes foram formados em placas de 96 poços ou discos de poliestireno e avaliados em diferentes tempos de desenvolvimento. A seguir foram construídas 4 cepas complementadas que foram avaliadas quanto à susceptibilidade a agentes estressantes, crescimento sob limitação de nutrientes e testes de filamentação. A arquitetura dos biofilmes foi analisada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os biofilmes também foram avaliados quanto à quantidade de β-1,3-glucana e quitina. Para os modelos de infecção, células epiteliais bucais (TR-146) foram utilizadas para análise de aderência, invasão e dano. A patogenicidade das cepas foi avaliada em ovos embrionados de galinha durante 7 dias, após a inoculação das cepas. Células planctônicas e biofilmes foram submetidos a testes antifúngicos com os agentes fluconazol, anfotericina B e caspofungina. A reação em cadeia da polimerase quantitativa foi realizada para verificar a expressão dos genes MRV8 e NDT80 em células fúngicas em interação com células epiteliais e MRV8, MRV1 e MRV6 em células crescidas em biofilme. Os resultados foram analisados por teste t de Student, ANOVA, Tukey e testes de Log-rank (Mantel-Cox) (p < 0,05). Foram construídas 4 cepas complementadas para os genes selecionados ORF19.823, ORF19.7170, ORF19.6847 e MRV8. A função de ORF19.823 ainda permanece desconhecida, pois não foi observado fenótipo significativo para a cepa mutante quanto aos testes realizados. A cepa mutante para ORF19.7170 ...

Candida albicans is an opportunistic fungi capable of causing superficial and systemic infections. Most of infections are mediated by biofilm formation which confers resistance to antifungal agents and immune system, but the mechanisms of biofilm development and pathogenicity were not thoroughly elucidated yet. In the presente study, 9 unknown function genes of C. albicans were selected among 34 mutant strains that presented altered phenotype for biofilm formation. The biofilms were formed on 96-well microtitle plates or on polystyrene disks and evaluated in different time intervals. Next, 4 complemented strains were constructed and evaluated for susceptibility to stressor agents, growth under nutrient limitation and filamentation tests. The biofilm architecture was analyzed by scanning electron microscopy (SEM). The biofilms were also assessed as the quantity of β-1,3-glucan and chitin. For the infection models, buccal epithelial cells (TR-146) were used for adherence, invasion and damage assays. The pathogenicity of the strains was evaluated in embrionated chicken eggs for 7 days, after inoculation of the strains. Planktonic cells and biofilms were submitted to antifungal tests with fluconazole, amphotericin B, and caspofungin. Quantitative polymerase chain reaction was performed to verify the expression of MRV8 and NDT80 genes in fungal cells in interaction with epithelial cells and MRV8, MRV1, and MRV6 genes in cells grown in biofilm. The results were submitted to the Student t test, ANOVA, Tukey's test, and Log-rank test (Mantel-Cox) (p < 0.05). Four complemented strains were constructed for the selected genes ORF19.823, ORF19.7170, ORF19.6847, and MRV8. The function of the ORF19.823 is still unknown, because the mutant strain did not show any significative phenotype for the tests performed. The mutant strain for the ORF19.7170 caused less damage on epithelial cells, but the result was not significant and the gene was dispensable for biofilm formation. ...

Estudo de genes de Candida albicans com função desconhecida quanto à formação de biofilme, características biológicas e interação patógeno- hospedeiro / Study of unknown function genes of Candida albicans as to biofilm formation, biological characteristics, and host-pathogen interaction

Candida albicans é um fungo oportunista capaz de causar infecções superficiais e até sistêmicas. A maioria das infecções é mediada pela formação de biofilme que confere resistência aos agentes antifúngicos e ao sistema imune, porém os mecanismos de desenvolvimento do biofilme e patogenicidade ainda não foram completamente elucidados. No presente estudo foram selecionados 9 genes de C. albicans com função desconhecida, dentre 34 cepas mutantes que apresentaram fenótipo alterado para formação de biofilme. Os biofilmes foram formados em placas de 96 poços ou discos de poliestireno e avaliados em diferentes tempos de desenvolvimento. A seguir foram construídas 4 cepas complementadas que foram avaliadas quanto à susceptibilidade a agentes estressantes, crescimento sob limitação de nutrientes e testes de filamentação. A arquitetura dos biofilmes foi analisada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os biofilmes também foram avaliados quanto à quantidade de β-1,3-glucana e quitina. Para os modelos de infecção, células epiteliais bucais (TR-146) foram utilizadas para análise de aderência, invasão e dano. A patogenicidade das cepas foi avaliada em ovos embrionados de galinha durante 7 dias, após a inoculação das cepas. Células planctônicas e biofilmes foram submetidos a testes antifúngicos com os agentes fluconazol, anfotericina B e caspofungina. A reação em cadeia da polimerase quantitativa foi realizada para verificar a expressão dos genes MRV8 e NDT80 em células fúngicas em interação com células epiteliais e MRV8, MRV1 e MRV6 em células crescidas em biofilme. Os resultados foram analisados por teste t de Student, ANOVA, Tukey e testes de Log-rank (Mantel-Cox) (p < 0,05). Foram construídas 4 cepas complementadas para os genes selecionados ORF19.823, ORF19.7170, ORF19.6847 e MRV8. A função de ORF19.823 ainda permanece desconhecida, pois não foi observado fenótipo significativo para a cepa mutante quanto aos testes realizados. A cepa mutante para ORF19.7170...

Candida albicans is an opportunistic fungi capable of causing superficial and systemic infections. Most of infections are mediated by biofilm formation which confers resistance to antifungal agents and immune system, but the mechanisms of biofilm development and pathogenicity were not thoroughly elucidated yet. In the presente study, 9 unknown function genes of C. albicans were selected among 34 mutant strains that presented altered phenotype for biofilm formation. The biofilms were formed on 96-well microtitle plates or on polystyrene disks and evaluated in different time intervals. Next, 4 complemented strains were constructed and evaluated for susceptibility to stressor agents, growth under nutrient limitation and filamentation tests. The biofilm architecture was analyzed by scanning electron microscopy (SEM). The biofilms were also assessed as the quantity of β-1,3-glucan and chitin. For the infection models, buccal epithelial cells (TR-146) were used for adherence, invasion and damage assays. The pathogenicity of the strains was evaluated in embrionated chicken eggs for 7 days, after inoculation of the strains. Planktonic cells and biofilms were submitted to antifungal tests with fluconazole, amphotericin B, and caspofungin. Quantitative polymerase chain reaction was performed to verify the expression of MRV8 and NDT80 genes in fungal cells in interaction with epithelial cells and MRV8, MRV1, and MRV6 genes in cells grown in biofilm. The results were submitted to the Student t test, ANOVA, Tukey's test, and Log-rank test (Mantel-Cox) (p < 0.05). Four complemented strains were constructed for the selected genes ORF19.823, ORF19.7170, ORF19.6847, and MRV8. The function of the ORF19.823 is still unknown, because the mutant strain did not show any significative phenotype for the tests performed. The mutant strain for the ORF19.7170 caused less damage on epithelial cells, but the result was not significant and the gene was dispensable for biofilm formation...

Comparison of disinfection protocol of irreversible hydrocolloid (alginate) impressions through plastic and metallic trays / Comparação do protocolo de desinfecção de moldes com hidrocolóide irreversível (alginato) em moldeiras plásticas e metálicas

Introduction: Many studies have evaluated the disinfection of irreversible hydrocolloid impressions through different disinfecting agents. However, impression trays can be source of cross-infection requiring disinfection. This study aimed to determine which would be the most suitable tray (metallic or plastic), available in dental market, and the ideal time to achieve disinfection by using 1% sodium hypochlorite poured into the alginate impression. Material and method: Thirty dental impressions from the patients aged from 7-12 years and treated in the Discipline of Orthodontics of the institution were divided into two groups according to the impression tray type: 15 impressions through plastic tray (Morelli) and 15 impressions through metallic tray (Tecnodent). The material collection was performed before and after the application of 1% sodium hypochlorite for 3, 5 and 10 min. After the incubation period of 48 h at 37 ºC, the microorganism colonies were counted on the plates presenting from 30 to 300 colonies to determine the colony-forming unit (CFU) per mL. CFU/ mL results were transformed into logarithm and submitted to statistical analysis by applying ANOVA and Tukey test (p ≤ 0.05). Results: Greater CFU percentage reduction occurred in alginate after three min, in both tray types. Concerning to tray types, it could be observed that the plastic tray showed 100% of reduction after 5 min while the metallic tray exhibited 81.49% of reduction after 3 min. Conclusion: 1 – The plastic tray showed the most effective disinfection after 5 min, with 100% of CFU reduction; 2 – The most effective time of disinfection with 1% sodium hypochlorite poured into the impression was 5 min, for both tray types.

Introdução: Muitos são os trabalhos que avaliam a desinfecção das moldagens com hidrocolóide irreversível e com diferentes agentes desinfetantes, mas as moldeiras também podem ser vetores de infecção cruzada e é necessária a sua desinfecção. A proposta do trabalho foi determinar qual a melhor moldeira (metálica ou plástica), disponíveis no mercado para a utilização do cirurgião dentista, e o tempo ideal para se obter a desinfecção utilizando o hipoclorito de sódio a 1% vertido na moldagem de com alginato. Material e método: Foram obtidas 30 moldagens de pacientes em tratamento na Disciplina de Ortodontia, do Curso de Odontologia, do ICT-UNESP-SJC, com idades entre 7 e 12 anos, divididas em dois grupos de acordo com o tipo de moldeira empregada: 15 moldagens com moldeiras de plástico (Morelli) e 15 com moldeiras de metal (Tecnodent). A coleta de material foi realizada antes e após a aplicação do hipoclorito de sódio a 1% durante 3, 5 e 10 min. Após período de incubação de 48 h a 37 ºC foram contadas colônias de microorganismos nas placas que apresentaram de 30 a 300 colônias para determinação de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) por mL. Os resultados em UFC/ mL foram transformados em logaritmo e submetidos à análise estatística Anova e teste de Tukey (p ≤ 0,05). Resultados: No alginato ocorreu uma maior redução percentual de UFC após 3 min, em ambas as moldeiras. Em relação a maior redução nas moldeiras, pudemos observar que a moldeira plástica ocorreu 100% de redução após 5 min e 81,49% de redução na moldeira metálica após 3 min. Conclusão: 1 - A moldeira plástica apresentou desinfecção mais eficiente, após 5 min, com redução de 100% de UFC; 2 - O tempo mais eficaz de desinfecção da moldagem com hipoclorito de sódio a 1% vertido na moldagem foi de 5 min, para moldeira de plástico e de metal.

Effect of photodynamic therapy on clinical isolates of Staphylococcus spp

Staphylococcus spp. are opportunistic microorganisms known for their capacity to develop resistance against antimicrobial agents. The objective of this study was to evaluate the effect of photodynamic therapy (PDT) on 20 Staphylococcus strains isolated from the human oral cavity, including S. aureus, S. schleiferi, S. epidermidis, S. capitis, S. haemolyticus, and S. lentus. A suspension of each Staphylococcus strain (10(6) cells/mL) was submitted to PDT using methylene blue and a low power laser. The isolated effects of methylene blue, laser treatment and ciprofloxacin were also evaluated. After the experimental treatments, 0.1 mL aliquots of the suspensions were seeded onto BHI agar for determination of the number of colony-forming units (CFU/mL). The results were analyzed by analysis of variance and Tukey's test (p < 0.05). The mean reduction in bacterial counts of the strains submitted to PDT ranged from 4.89 to 6.83 CFU (log10)/mL, with the observation of a decreasing susceptibility to treatment of S. schleiferi, S. haemolyticus, S. epidermidis, S. capitis, S. aureus, and S. lentus. The results showed that PDT was effective in reducing the number of viable cells of all clinical Staphylococcus isolates studied.

Atividade antifúngica do óleo essencial de melaleuca alternifolia sobre leveduras isoladas de candidíase bucal de gestantes HIV positivas / Antifungal activity of melaleuca alternifolia essential oil on yeasts isolated from HIV positive pregnant women with oral candidiasis

A candidíase bucal é a infecção fúngica mais comum em portadores de HIV e, com episódios recorrentes em pacientes com Aids. Com o objetivo de pesquisar novos e eficazes agentes antifúngicos contra cepas resistentes, foi investigada a atividade antifúngica do óleo essencial de Melaleuca alternifolia, em diferentes concentrações, em leveduras isoladas de candidíase oral. O experimento foi realizado por meio da técnica de difusão em ágar. Foram avaliadas cepas padrão de Candida albicans ATCC 10231, Candida tropicalis ATCC 157, Candida glabrata ATCC 30070, Candida krusei ATCC 6258 e Candida dubliniensis ATCC 778157e os isolados da cavidade bucal de gestantes HIV positivas, sendo sete C. albicans, um C. tropicalis, um C.glabrata e um C. krusei. O óleo essencial foi analisado nas quantidades de 20 e 50 μL, nas concentrações de 10 a 100%, variando de 10 em 10%. Todas as cepas analisadas foram suscetíveis ao óleo essencial de M.alternifolia nas concentrações de 70% e 50 %, respectivamente, nos volumes de 20 μL e 50 μL. O potencial antifúngico do óleo essencial de M. alternifolia desperta interesse para o desenvolvimento de novos fármacos.

Oral candidiasis is a fungal infection mostly common in people infected with HIV and the recurrent episodes occur in patients with AIDS. Aiming at searching, a new and efficacious drug against resistant strains, the antifungal activity of essential oil from Melaleuca alternifolia at different concentrations was assessed on yeasts isolated from oral candidiasis. The experiment was performed by using agar diffusiontechnique; and the antifungal effect was evaluated on the standard strains of Candida albicans ATCC 10231, Candida tropicalis ATCC 157, Candida glabrata ATCC 30070, Candida krusei ATCC 6258 and Candida dubliniensis ATCC 778 157, and on the isolated from the oral cavity of HIV positive pregnant women, being seven C. albicans, one C. tropicalis, one C glabrata and one C. krusei. The essential oil was analyzedin quantities of 20 and 50 μL at 10-100% concentrations, ranging from 10 to 10%. All of the tested strainswere susceptible to the M. alternifolia essential oil at concentrations of 70% and 50% in volumes of 20 μL and 50 μL, respectively. The antifungal activity of essential oil from M. alternifolia holds one´s attention in manufacturing new and effective drugs.

Atividade antifúngica do óleo essencial de Cymbopogon citratus frente a cepas de Candida albicans e Candida tropicalis isoladas de infecções nosocomiais / Antifungal activity of Cymbopogon citratus essential oil on Candida albicans and Candida tropicalis strains isolated from nosocomial infections

O óleo essencial de Cymbopogon citratus tem sido alvo de vários estudos em função do potencial antimicrobiano. Neste estudo, a atividade desse componente foi investigada em cepas do gênero Candida isoladas de infecções hospitalares. Para a condução do estudo, foram analisadas 24 isolados de Candida albicans e 15 isolados de Candida tropicalis, originados de pacientes com suspeitas de infecção hospitalar e uma cepa padrão de C. albicans ATCC 10231, por meio da técnica de difusão em ágar. O óleo essencial de C. citratus apresentou atividade antifúngica em 100% dos isolados a partir da concentração de 25% (v/v), o que indica sua ação positiva sobre as cepas hospitalares. Sugere-se a realização de estudos farmacológicos e toxicológicos desse componente para avaliar a possível aplicação clínica.

Atividade antifúngica dos extratos glicólicos de Rosmarinus officinalis Linn. e Syzygium cumini Linn. sobre cepas clínicas de Candida albicans, Candida glabrata e Candida tropicalis / Antifungal activity of glycolics extracts of Rosmarinus officinalis Linn. and Syzygium cumini Linn. on clinical strains of Candida albicans, Candida glabrata and Candida tropicalis

O objetivo deste estudo consiste em avaliar in vitro o potencial antifúngico dos extratos glicólicos de Rosmarinus officinalis Linn. (alecrim) e Syzygium cumini Linn. (jambolão) sobre cepas clínicas de Candida albicans (n = 14), Candida glabrata (n = 8) e Candida tropicalis (n = 8). A Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi determinada por meio de diluições seriadas dos extratos (100 a 3,125 mg.mL­1) em caldo Sabouraud, que foram posteriormente inoculados com suspensões fúngicas (106 células.mL­1). Estes ensaios permaneceram incubados a 37 °C, por 24 horas. Após o período de incubação, os ensaios que não apresentaram crescimento no caldo foram semeados em ágar Sabouraud e incubados a 37 °C por 48 horas, para determinar a Concentração FungicidaMínima (CFM). Para a maioria das cepas estudadas, a CIM do extrato de Rosmarinus officinalis Linn. foi similar ao extrato de Syzygium cumini Linn., correspondendo a 25 mg.mL­1 para C. albicans, 25 mg.mL­1 para C. glabrata e 12,5 mg.mL­1 para C. tropicalis. Os valores de CFM dos extratos de Rosmarinus officinalis Linn. e Syzygium cumini Linn. foram, respectivamente, 25 e 50 mg. mL­1 para C. albicans, 50 mg.mL­1 para C. glabrata e 25 mg.mL­1 para C. tropicalis. Conclui-se que os extratos glicólicos de Rosmarinus officinalis Linn. e Syzygium cumini Linn. apresentaram potencial antifúngico para todas as cepas de Candida estudadas, sendo que as cepas de C. tropicalis demonstraram-se mais sensíveis aos extratos em relação a C. albicans e C. glabrata.

The aim of this study was to evaluate in vitro antifungal potential of extracts glycolics Rosmarinus officinalis Linn. (rosemary) and Syzygium cumini Linn. (jambolan) on clinical strains of Candida albicans (n = 14), Candida tropicalis (n = 8) and Candida glabrata (n = 8). The minimal inhibitory concentration (MIC) was determined by serial dilution of the extracts (100 to 3125 mg. mL­1) in Sabouraud broth, which were then inoculated with fungical suspensions (106 cells.mL­1) and incubated at 37 °C / 24 hours. After the incubation period, the assays of theprevious test which showed no growth in broth were planted in Sabouraud agar and incubated at 37 °C / 48 hours to determine the Minimal Fungicidal Concentration (MFC). For most strains studied,the MIC of the extract of Rosmarinus officinalis Linn. was similar to the extract of Syzygium cumini Linn., corresponding to 25 mg.mL­1 for C. albicans, 25 mg.mL­1 for C. glabrata and 12.5 mg.mL­1 for C. tropicalis. The MFC of extract of Rosmarinus officinalis Linn. and Syzygium cumini Linn. was, respectively, 25 and 50 mg.mL?1 for C. albicans, 50 mg.mL­1 for C. glabrata and 25 mg.mL­1 for C. tropicalis. It concluded that the extracts of glycolics Rosmarinus officinalis Linn. and Syzygiumcumini Linn. showed potential antifungal for all strains of Candida studied, and the strains of C. tropicalis shown to be more sensitive to extracts in relation to C. albicans and C. glabrata.